用LIC三天构建一个质粒——第三天

今天是LIC的最后一天，只有两个简单任务，检验平板上是否有菌落，并通过菌落PCR来确定单一菌落是否含有目的质粒（阳性）；将阳性菌落接种到LB培养基中，过夜培养，以便于提取质粒进行测序。

1. 菌落PCR

过夜生长在琼脂糖- LB平板上的菌落，过目可知。也许你会很惊讶，为什么LIC后的平板上只有可怜的几个菌落？是的，这是正常的。根据我们的经验，这些单一菌落是目的质粒的可能性非常大。相反，如果你的琼脂糖- LB平板上到处是菌落，那这些菌落是假阳性的概率很高。能够生长在这些含有抗生素的平板上的菌落必定含有抗性基因，因此，这些假阳性菌落多半是含有template的质粒。进一步分析，应该是Bpn1消化过程中出现了差错。菌落PCR是检验这些菌落是否含有insert的直接方法。菌落PCR的DNA模板就是这些菌落——将移液器的枪头在标记好的菌落上点一下（挑取），然后吹打进PCR反应体系中即可。标记菌落的目的是为了在下次寻找相应的阳性菌落的时候，简单快捷。菌落PCR的引物就是insert PCR的引物，无需额外定制引物。菌落PCR的反应条件（退火温度，延伸时间）与insert PCR的一致。细心的小伙伴甚至会用提供template的质粒作为隐性对照，以提供insert的质粒作为阳性对照。总结的时候，将template PCR, insert PCR 和菌落PCR并排放在一起的时候，完成的LIC实验过程就出来了，如图一。

图一. Template PCR, insert PCR 和菌落PCR的电泳结果。选取的两个菌落都是阳性。

 

当平板上有大量菌落时，应该多挑取一些菌落作PCR。如下图，我们挑取了7个菌落做PCR，但是，只有#4 菌落含有insert。(这里能检测出#4，含有运气成分。)

图二. Template PCR, insert PCR和菌落PCR的电泳结果。选取的7个菌落，只有一个是阳性。

 

LIC的反应体系是10 ul，而一个转化反应通常只需要5 ul。因此，为了避免浪费，5 ul可以转化到DH5a 中，专门用来提取目的质粒；另外5 ul转化到BL21 （升级版本的叫作Rosetta）中，专门用来做目的蛋白的表达和纯化。

 

2. 过夜培养含有Insert的菌落用来测序

测序的目的主要是1）确定insert的阅读框是否与标签蛋白（酶切位点）的阅读框一致；2）目标蛋白的DNA序列末尾处含有终止密码。尽管当前测序技术发展非常迅捷，但是测序结果的前端总是容易出现系统误差，因而，我们一般不直接采用insert PCR的引物来进行测序，而是使用T7 pro或者T7term来进行测序。如果使用GST标签蛋白，一般可以使用pGEX引物进行测序。

总结

LIC以同源重组为基本原理，利用T4 DNA聚合酶的3′-5′外切酶活性使template和insert产生黏性末端，通过同源序列在体外完成交换重组，并进一步利用E.coli细胞内的ligase自行修复目的质粒，实现基因克隆目的。使用Bpn1对模板DNA（甲基化）进行消化，有利于消除假阳性信号，是LIC的关键步骤之一。经菌落PCR鉴定为阳性的菌落，通常含有目的质粒。同源序列是精心设计的重复片段，是IDT合成的引物，能在很大程度上保证不会出现阅读框漂移。总之，LIC技术在目的基因克隆、蛋白的融合表达方面具有很强的应用前景。希望小伙伴们自此对该领域有一个比较深入和系统的认识，挖掘LIC技术在基因重组领域的应用潜力。

用LIC三天构建一个质粒——第二天

今天是利用LIC构建质粒的极其重要的一天。我们需要进行2个高保真PCR反应，进行胶回收，从而获得线性的template和insert；需要进行LIC反应；需要将LIC反应产物分别转化到DH5a（用于质粒提取）和BL21（用于蛋白表达）中，并接种到琼脂糖- LB平板中。 

1. PCR反应

早上来到实验室后，立即从lab manager那里收取template和insert的引物，分别用超纯水配置成10 uM的溶液（50 ul就好），冰浴。从过夜培养的E.coli中，分别提取2个PCR 反应所需的模板，确定浓度，冰浴。将高保证聚合酶PCR mix (以Q5 为例)和超纯水从冰箱中取出，冰浴。按下面体系分别进行PCR反应 (25 ul)，每个PCR做一个重复：

图一. PCR反应体系已经PCR条件设置。

（https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491）

 

PCR反应是分子克隆的基础，也是决定LIC成功与否的关键一步。要想获得单一的条带，必须设置：1）良好的退火温度；2）相对准确的延伸时间。退火温度是根据引物Fwd和Rev的Tm值（IDT为每个引物都提供Tm值）来确定的。在实践中，一般采用相对较低的Tm + 3oC为准。例如，Fwd和Rev的Tm分别为59.1oC和65.2oC，那退火温度就设置为62.1oC。当Tm + 3oC > 72oC时，进行“2-step”PCR，即退火温度和延伸温度都是72 oC。延伸时间是根据template或者insert长度来设置的。上文构建的Kan-T7pro-his6-MBP-Tev-humanHP1a-T7term-Lac质粒，template （6388 bp,） insert （576 bp），其PCR延伸时间应该分别设置为195s 和30s。当你的PCR获得了单一的条带时（如图三），你已经成功了一半。

图二. PCR反应获得单一条带。

2. Bpn1消化PCR反应的模板DNA并胶回收

当发现PCR产物是单一条带时，立即将PCR产物进行Bpn1消化（50 ul, 37oC， 1小时）。（这是去吃中饭的最佳时间！！！）Bpn1特异性的消化甲基化的DNA，即PCR反应中加入的DNA模板。template PCR过程中加入的DNA模板(甲基化的plasmid)，在PCR完成后是必须经过Bpn1消化——这个甲基化的plasmid含有与目的质粒相同抗性基因。不去掉这个甲基化的plasmid，LIC后长在平板上的菌落会很多；但是，它们多半是假阳性的。同理，如果insert PCR的DNA模板也含有与目的质粒相同抗性基因，那么其PCR反应也需要Bpn1消化。当电泳结果显示为单一条带（如图二），在Bpn1消化后，你可以跳过电泳和胶回收，直接利用PCR DNA 提取试剂盒，提取PCR产物。这种方法获得PCR产物比较高效。当电泳结果显示为2-3条条带时，只好根据DNA marker的大小来切取目的片段。此时，获得PCR产物的浓度有可能偏低。 

3. LIC反应

胶回收后，LIC 的反应体系（10 ul）就可以建立了，如下：
template, 50-100 ng;insert, 100-200 ng;

0.25 ul T4 DNA pol。

LIC 的反应体系（10 ul）建立后，先常温下静置10分钟，再冰浴20分钟（阻止过度反应）。将LIC 的反应混合物，5 ul 加入到DH5 感受态（50 ul）中，5 ul加入到BL21 感受态(50 ul) 中，冰浴15分钟，让反应产物与感受态充分接触。 

4. 转化与涂平板

将感受态细胞分别热激，42oC，30s; 然后，冰浴5 分钟。在含有感受态的EP管中，加入500 ul的LB培养液（不要加入任何的抗生素）, 然后置于培养箱中37oC， 220 rpm, 40分钟。最后，涂平板。 

小结

今天是格外繁忙的一天。2个PCR反应3小时，跑胶看条带30分钟。吃饭之前，Bpn1消化1小时。胶回收1小时，LIC反应40分钟，转化20分钟。培养，40分钟。涂平板，10分钟。几乎8个小时。早九晚五就好，回家睡觉。明天，我们看平板，检验自己的动手能力。

实战｜用LIC三天构建一个质粒——第一天

大规模的基因表达是研究蛋白质结构和功能的基础。基因表达需要构建相应的表达载体——DNA片段或者质粒。LIC（音“立刻”）技术，全称为ligation–independent cloning （不依赖于连接反应克隆），已经在表达载体的构建方面得到了广泛应用。LIC技术提高了表达载体构建过程中的连接效率，降低了克隆产物假阳性率，是一个对初学者极其友好的分子克隆手段。其过程如下：准备好插入片段（insert，含有目的蛋白基因序列）和LIC载体（template，含有抗性蛋白，启动子，标签蛋白和标签蛋白切除位点）后，使用T4酶产生相对较长的黏性末端，直接转化入宿主细胞（E.coli）, 让E.coli自己完成连接（Ligation）过程。LIC不依赖于基因序列，不需要体外连接反应，是简化的、高效的分子克隆技术。本文将与大家分享如何在材料齐全的情况下，在三天内利用LIC高效地构建一个质粒的第一天。

01 设计质粒

所谓的设计质粒，其实就是将template和insert直接连接在一起的过程。设计后的质粒的线性排列如下：抗性蛋白—启动子上游—标签蛋白—切割位点—insert—启动子下游—Lac 操纵子。一般情况下，需要根据所在室验室的偏好来选择template，确定其基因序列。准备做基因表达的实验室，一般都含有一些能够表达蛋白的质粒（如果是新实验室，可以直接从Addgene上购买含有目的template的E.coli）。抗性蛋白为E.coli提供抗性（抗生素，如Amp或者 Kan，），从而只有含有载体的E.coli可以生长，表达目的蛋白。启动子是RNA聚合酶结合的位置（不是翻译的起始点）。标签蛋白可以是His6, His6-Sumo, his6-MBP, GST，或者GFP。标签蛋白是翻译的起始位点。在分离纯化的后期，尤其是研究蛋白结构的时候，表达的标签蛋白常常需要被切割掉，因此标签蛋白和目的蛋白之间通常需要插入蛋白酶切割位点，如 Tev, Thrombin或者ULP1等。蛋白酶切割位点后通常不插入任何碱基，直接插入完整的目的蛋白的基因序列（反复确认，保证阅读框与前面的蛋白酶切割位点重合）。切记，在完整的目的蛋白的基因序列之后，加入终止密码（TAA 或者TAG）。终止密码后的启动子下游—Lac 操纵子直接粘贴原始的载体序列即可。例如：

1）. Kan-T7pro-his6-MBP-Tev-Insert-TAA-T7term-Lac

2）. Amp- T7pro-GST-Thrombin-Insert-TAA- T7term -Lac

假设我们采用Addgene的 pMJ806为template（提供Kan-T7pro-his6-MBP-Tev……T7term-Lac）,需要将人 的全长HP1a 插入进该template。从而，表达his6-MBP-（Tev）-HP1a多肽链（进行Tev切割后，剩下全长HP1a）。

图一. Addgene pMJ806 (由Jennifer Doudna提供)的环形图，以及人源全长HP1a.

 

进行拼接后，我们获得了表达人源全长HP1a的目的质粒（纸面上的）。其环形图如下：

图二. 构建的目的质粒环形图，包含有Kan-T7pro-his6-MBP-Tev-humanHP1a-T7term-Lac，全长为6964bp (insert, 576bp; template 6388 bp)。

 

02 设计引物

LIC需要 2个线性DNA片段（一个是template，一个是insert）来进行反应，形成最终的环形质粒。这两个DNA片段都是有PCR反应完成的。要进行这2个PCR反应，就必须设计2对引物。这两对引物都可以（必须）根据已经设计好的目的质粒来设计。Template的引物设计相对简单，只需20 bp左右。Insert的引物设计相对复杂，它必须包含一部分template（10-15 bp）和一部分insert（~20 bp）。引物的结尾处最好以G核苷酸为最佳。具体如下图。

图三. LIC的引物设计。

 

从上图可以看出，LIC的引物设计是非常严苛的，呆板的。载体的引物位点是严格控制的，一半以终止密码为起始，包含～20个碱基对；另一半在蛋白酶切割位点处。Insert的上下游引物都必须包含一部分template，一部分insert的碱基序列，因此相对较长，～35bp。在50 bp内，IDT的DNA合成准确率是可以保证的，因此不必担心含有突变。

 

03 订购引物，准备PCR的模板

设计了引物之后，确认没有错误，那就可以立刻订购引物了。IDT的引物非常快，一般第二天就可以。同时，两个PCR反应需要与之对应的DNA模板——培养相应的DH5a，过夜，分别提取质粒。

 

04 为第二天的PCR和LIC反应做准备

准备高保真PCR反应所需的PCR mix，提前预定第二天上午的PCR仪（2个）；准备Bpn1（一种甲基化DNA切割酶）；准备DNA琼脂糖凝胶提取试剂盒。准备T4酶（具有3’->5’DNA 切割能力）。准备感受态E.coli（DH5a 和BL21）；准备LB培养基，琼脂糖-LB培养基（Kan）。

 

小结

用LIC，三天构建一个质粒，不是梦。第一天的任务相对简单：1）设计质粒（复制，粘贴），约20分钟；核查3分钟；2）设计引物，20分钟；核查3分钟；订购引物（交给lab manager）1 分钟；3) 培养含有PCR反应模板的E.coli, 30 min; 4) 准备第二天的试剂。除了LB培养基和琼脂糖-LB培养基需要自己准备，其他的都是实验室长备的东西。因此，第一天的任务相对轻松，满打满算3个小时的活。如果小伙伴们有任何疑问，欢迎留言。明天，我们继续LIC。